UV分光光度计的原理
紫外可见吸收光谱的基本原理是利用在光的照射下待测样品内 部的电子跃迁，电子跃迁类型有：
（1）σ→σ* 跃迁 指处于成键轨道上的 σ 电子吸收光子后被激发跃迁到 σ* 反键轨道
（2）n→σ* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的 n 电子吸收能量后向 σ*反键轨 道的跃迁
（3）π→π* 跃迁 指不饱和键中的 π 电子吸收光波能量后跃迁到 π*反键轨 道。
（4）n→π* 跃迁 指分子中处于非键轨道上的 n 电子吸收能量后向 π*反键轨 道的跃迁
。 电子跃迁类型不同，实际跃迁需要的能量不同： σ→σ* ～150nm n→σ* ～200nm π→π* ～200nm n→π* ～300nm
吸收能量的次序为：σ→σ*＞n→σ*≥π→π*＞n→π*
特殊的结构就会有特殊的电子跃迁，对应着不同的能量（波长），反反映在紫 外可见吸收光谱图上就有一定位置一定强度的吸收峰，根据吸收峰的位置和强度就可 以推知待测样品的结构信息。
UV分光光度计的操作顺序
1．接通电源
； 开电脑主机；
2.进入控制软件界面；
3. 选择所用程序（ Scan扫描为例 扫描为例）
4. 设置仪器参数；
4．确定测定波长（扫描）；
5. 测定试样；
6．测定试样；
7．仪器复原。
UV分光光度计的应用
物质的紫外吸收光谱基本上是其分子中生色团及助色团的特征，而不是整个分子 的特征。 如果物质组成的变化不影响生色团和助色团， 就不会显着地影响其吸收光谱， 如甲苯和乙苯具有相同的紫外吸收光谱。另外，外界因素如溶剂的改变也会影响吸收 光谱，在极性溶剂中某些化合物吸收光谱的精细结构会消失，成为一个宽带。所以， 只根据紫外光谱是不能完全确定物质的分子结构，还必须与红外吸收光谱、核磁共振 波谱、质谱以及其他化学、物理方法共同配合才能得出可靠的结论。
化合物的鉴定
利用紫外光谱可以推导有机化合物的分子骨架中是否含有共轭结构体系， C＝C 如 －C＝C、C＝C－C＝O、苯环等。利用紫外光谱鉴定有机化合物远不如利用红外光谱有 效，因为很多化合物在紫外没有吸收或者只有微弱的吸收，并且紫外光谱一般比较简 单，特征性不强。利用紫外光谱可以用来检验一些具有大的共轭体系或发色官能团的 化合物，可以作为其他鉴定方法的补充。
（1）如果一个化合物在紫外区是透明的，则说明分子中不存在共轭体系，不含 有醛基、酮基或溴和碘。可能是脂肪族碳氢化合物、胺、腈、醇等不含双键或环状共 轭体系的化合物。
（2）如果在 210～250nm 有强吸收，表示有 K 吸收带，则可能含有两个双键的共 轭体系，如共轭二烯或 α，β-不饱和酮等。同样在 260，300，330nm 处有高强度 K 吸收带，在表示有三个、四个和五个共轭体系存在。
（3）如果在 260～300nm 有中强吸收（ε＝200～1 000），则表示有 B 带吸收， 体系中可能有苯环存在。 如果苯环上有共轭的生色基团存在时， ε 可以大于 10 000。 则
（4）如果在 250～300nm 有弱吸收带（R 吸收带），则可能含有简单的非共轭并 含有 n 电子的生色基团，如羰基等。
纯度检查
如果有机化合物在紫外可见光区没有明显的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸 收，则可利用紫外光谱检验化合物的纯度。如果有机化合物在紫外可见光区没有明显 的吸收峰，而杂质在紫外区有较强的吸收，则可利用紫外光谱检验化合物的纯度。
异构体的确定
异构体的确 定 对于异构体的确定，可以通过经验规则计算出 λmax 值，与实测值比较，即可证 实化合物是哪种异构体。如: 乙酰乙酸乙酯的酮-烯醇式互变异构
位阻作用的测定
由于位阻作用会影响共轭体系的共平面性质，当组成共轭体系的生色基团近似处 于同一平面，两个生色基团具有较大的共振作用时，λmax 不改变，εmax 略为降低， 空间位阻作用较小；当两个生色基团具有部分共振作用，两共振体系部分偏离共平面 时，λmax 和 εmax 略有降低；当连接两生色基团的单键或双键被扭曲得很厉害，以 致两生色基团基本未共轭，或具有极小共振作用或无共振作用，剧烈影响其 UV 光谱 特征时，情况较为复杂化。在多数情况下，该化合物的紫外光谱特征近似等于它所含 孤立生色基团光谱的“加合”。
氢键强度的测定
溶剂分子与溶质分子缔合生成氢键时，对溶质分子的 UV 光谱有较大的影响。对 于羰基化合物，根据在极性溶剂和非极性溶剂中 R 带的差别，可以近似测定氢键的强 度。溶剂分子与溶质分子缔合生成氢键时，对溶质分子的 UV 光谱有较大的影响。对 于羰基化合物，根据在极性溶剂和非极性溶剂中 R 带的差别，可以近似测定氢键的强 度。
定量分析
朗伯-比尔定律是紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的理论基础，它的数 学表达式为: A = ε b c UV-2550
UV分光光度计的注意事项
1、使用的吸收池必需洁净，并注意配对使用。量瓶，移液 管均应校正后使用。
2、取吸收池时，手应拿毛玻璃面的两侧盛装样品以池体的 4/5 为度，使 用挥发性溶液时应加盖，透光面要用插镜纸由上而下摖拭干净，检视应无溶剂残留。吸收池 放入样品室时应注意方向相同。用后用溶剂或水冲洗干净，晾干防尘保存。
3、供试品溶液浓度除各该品种已有注明外，其吸收度以在 0.3~0.7 之间为宜。
4、测定时除另有规定外，应以配制供试品溶液的同批溶液为空白对照，采用 1cm 石英吸收 池，在规定峰+-2nm 以内，测几个点的吸收度或由仪器在规定波长附近自动扫描测定，以 核对供试品的吸收峰位置是否正确， 并以吸收度最大的波长作为测定波长， 除另有规定吸收 度最大波长应在该品种下规定的测定波长+-2nm 以内
5、供试品应取 2 份，如为对照品比较法，对照品一般也应取两份。平行操作，每份结果对 平均值的偏差应在+-0.5%以内
6、选用仪器的狭缝宽度应小于供试品吸收带的半宽度，否则测得的吸收度会偏低，狭缝宽 度的选择应以减少狭缝宽度时供试品的吸收度不再增加为准， 对于大部分被测品种， 可以使 用 2nm 缝宽。
