目的
采用SPA法在镀金电极表面进行抗体固定,探索压电免疫传感器再生使用的最佳条件。
方法
对压电免疫传感器的检测时间、特异性,及再生试验的最佳试剂、时间进行实验研究。
结果
构建的压电免疫传感器检测时间为15min,无交叉反应;NaOH溶液再生10次后,频率响应下降为原有的75%。
结论
所构建的压电免疫传感器检测时间短,特异性好,可用于临床标本的检测,NaOH溶液用于石英晶体再生的效果较好,极大地降低了使用成本。
压电石英晶体免疫传感器(piezoelectric quartz crystal immunosensor)作为一种新型生物传感器, 是利用石英晶体对质量变化的敏感性,结合生物识别系统(抗原抗体特异性结合)而形成的一种自动化分析检测系统,具有灵敏度高、特异性好、响应快、小型简便等特点。可对多种抗原或抗体进行实时、快速、在线、连续的定量测定及反应动力学研究,克服了酶联免疫分析法(ELISA)、放射免疫分析法 (RIA)、荧光免疫分析法(FIA)等免疫检测方法费时、昂贵、标记及操作繁琐等缺点,具有极广泛的发展前景及临床使用价值,成为生物传感器领域的研究热点[1,2]。
生物传感器商业化要具备以下几个条件:足够的敏感性和准确性、易操作、价格便宜、易于批量生产并能在生产过程中进行质量监测。其中,价格便宜决定了传感器在市场上有无竞争力。而在各种生物传感器中,压电石英晶体免疫传感器最大的优点就是成本低、操作简便、设备简单,因此在市场上的前景是十分巨大和诱人的。电极的再生是发展免疫传感器中重要的一环,再生使用使石英晶体免疫传感器的价格大大降低。由于抗原抗体结合能力强, 反应后不易分开,要使免疫传感器重复使用,就要用一些试剂将抗原抗体复合物解离或从传感器表面全部清洗下来,前者还需不损害固相抗原或抗体的活性。用于解离或洗涤的试剂有柠檬酸盐缓冲液、乙醇胺、磷酸盐2柠檬酸缓冲液、强酸强碱加超声清洗、甘氨酸2盐酸缓冲液、二乙胺、丙酸、乙二醇[3]、尿素[4]、盐酸胍缓冲液[5]和四氢呋喃[6]等。可用于传感器再生的试剂很多,在具体操作过程中应根据固定技术的不同及所包被抗原、抗体的不同,选择相应的试剂及作用时间。
1 材料与方法
1·1 实验材料
1·1·1 AT切型、双面镀金电极、基频10MHz的石英晶体
采用自制2×5路独立的自激式振荡电路单元组成阵列式检测电路模块(信息产业部电子第26研究所),频率信号为TTL电平输出;将检测电路模块封装于不锈钢金属壳内,并设置恒温、屏蔽和防震装置,组装成2×5路压电石英晶体传感器振荡频率检测平台(中国嘉陵集团)。自行设计的《PESA 2·0频率采集分析软件》具有频率计数、差值显示和频率变化趋势图显示等功能。自行改进后的多通道PCL2836多功能频率计数卡(台湾研发公司产品)内置于方正计算机。
1·1·2 仪器
IMMAGE特定蛋白分析仪(美国Beckman公司产品)。
1·1·3 试剂
抗人免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)单克隆抗体(美国Beckman公司);抗人免疫球蛋白(IgD、IgE)单克隆抗体(美国Nordic公司);葡萄球菌A蛋白(SPA)(美国Pierce公司产品);人免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM)标准血清(美国Beckman公司);人免疫球蛋白(IgD、IgE)标准血清(北京生物制品研究所);牛血清白蛋白(BSA)(Sigma公司);PBS缓冲液:0·05M,pH 7·2,NaCl(9g/L)自行配制;1·0M、1·2M的NaOH溶液;1·0M的HCl溶液;8·0M的尿素溶液;95%的乙醇溶液(自行配制);IgD、IgE ELISA试剂盒(天津新传生物工程公司);所用其他试剂均为AR级。
1·2 实验方法
1·2·1 抗体的固定
(1)石英晶体金膜表面的预处理:将石英晶体浸入1M的氢氧化钠(NaOH)溶液中浸泡10 min,三蒸水清洗后,浸入1M的盐酸(HCl)溶液中浸泡10 min,三蒸水及95%乙醇清洗后,氮气吹干备用。(2)石英晶体传感器微阵列的制备:石英晶体器件的性能测试:首先用分析仪测定石英晶体的Q值、阻抗、频率,以确定该晶体是否可以使用。石英晶体稳定性测试:把Q值、阻抗、频率较为接近的石英晶体固定在2×5型微阵列内,组装成石英晶体传感器微阵列,测试其稳定性后,即可用于后续免疫传感器的制备。(3)抗体的固定:SPA的包被:将SPA溶液5μl(1mg/ml)均匀涂布于石英晶体金膜表面,22℃条件下包被0·5h;洗涤:将上述包被了SPA的石英晶体分别用0·05M的PBS缓冲液(pH7·2)和双蒸水冲洗3~5次,氮气吹干备用;抗体的固定:将抗人免疫球蛋白单克隆抗体5μl,均匀涂布于已包被了SPA的石英晶体金膜表面;封闭:抗体固定后的石英晶体,用PBS缓冲液冲洗10次,再加入1%的BSA溶液100μl,反应1h,封闭晶体表面未结合的活性位点;洗涤:封闭后的石英晶体分别用0·05M的PBS缓冲液(pH7·2)和双蒸水冲洗3~5次,氮气吹干,4℃冰箱保存备用。
1·2·2 石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的组装
(1)石英晶体免疫传感器微阵列:采用2×5型拔插式石英晶体微阵列。(2)石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的分布排列:压电免疫球蛋白免疫传感器微阵列的分布排列如图1所示。整个微阵列分为Y1、Y2两行,X1、X2、X3、X4、X5共5列。Y1行为参比行,Y2行为检测行。X1、X2、X3、X4、X55列依次为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE检测组合。参比晶体不固定抗体分子,仅用BSA封闭,以消除血清标本在检测过程中的物理吸附等影响因素。(3)石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的组装:把包被了抗体的石英晶体固定在拔插式微阵列中,形成检测池。
1·3 检测步骤
(1)压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列与石英晶体振荡检测平台相连接,观察在气相条件下阵列中各晶振单元的振荡情况,调节或剔除频率不稳定的晶体。(2)向各检测单元中加入PBS检测缓冲液(pH7·2)100μl,调整石英晶体液相中的振荡频率至稳定,记录液相基频f1。(3)在微阵列检测池中分别加入对应的两倍稀释的标准血清或临床检测标本5μl, 37℃条件下检测频率的变化至频率稳定,记录稳定后的频率f2。(4)计算免疫反应所导致的频率变化,△f=f1~f2。(5)石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列检测标准曲线的绘制:免疫传感器微阵列各项检测的标准曲线分别用其相应的标准血清,每个浓度点的传感器频率响应值(△f=f1~f2)用3次平行检测结果的平均值表示,并用参比检测值进行校正。以标准溶液浓度为横坐标,频率变化的绝对值为纵坐标作图。
1·4 临床标本的检测
(1)临床标本的检测:收集我科免疫室临床检测IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的门诊及住院患者临床标本50例,其中男15例,女35例,平均年龄37岁,按上述步骤进行检测。(2)石英晶体免疫球蛋白免疫传感器的再生重复使用:压电石英晶体免疫球蛋白传感器检测使用后,分别用1·2M的NaOH溶液再生2min或用8·0M的尿素溶液再生2min,双蒸水和PBS缓冲液冲洗后,再用于相同浓度免疫球蛋白标准血清的检测,以检测其再生效果。(3)IgG、IgA、IgM、IgD、IgE的对照检测:IgG、IgA、IgM用IMMAGE检测仪和该公司生产的试剂,采用速率散射比浊法定量检测;IgD、IgE采用ELISA方法检测。
1·5 统计学分析
实验数据采用SPSS10·0统计分析软件进行线性回归分析、r检验。
2 结 果
2·1 压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的响应特性
2·1·1 传感器检测时间的确定
将待测物分别加入传感器阵列中相应的检测单元中,37℃条件下检测石英晶体振荡频率的变化直至频率稳定,观察石英晶体振荡频率变化与抗原2抗体反应时间之间的关系。图2为免疫传感器微阵列检测IgG的频率变化趋势图。从图中可以清楚地看出加入待测物后,石英晶体的振荡频率逐渐下降,当免疫反应进行约15 min时,石英晶体的振荡频率基本稳定,继续观测5 min,其振荡频率基本无变化,表明抗原2抗体反应已达到平衡,免疫反应已结束。因此,确定15 min为压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的检测时间。
2·1·2 压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列检测的特异性
用免疫传感器微阵列分别交叉检测其他4种免疫球蛋白标准血清,检测时间达15 min后记录石英晶体振荡频率的变化,结果见表1。结果表明构建的压电石英晶体免疫传感器所检测的待测物间无交叉反应,说明构建的压电石英晶体免疫传感器特异性好,选择性高,可满足临床检测的需要。
2·2 压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列对临床标本的检测
利用构建的压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器对50例临床标本分别进行IgG、IgA、IgM、IgD、IgE检测。检测结果与散射比浊法、ELISA法的检测结果进行线性相关分析,结果见表2。结果显示,压电石英晶体免疫传感器微阵列检测法与其他免疫检测法的结果相符(P>0·05)。
2·3 压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器的再生将使用过的石英晶体从免疫传感器微阵列中卸出,置于1·2M的NaOH溶液或8·0M的尿素溶液中再生2min,经双蒸水和PBS缓冲液冲洗后,再用于相同浓度免疫球蛋白标准血清的检测。结果表明,再生后的石英晶体仍具有良好的频率响应特性,但其响应特性随再生次数的增加而逐渐降低。其中NaOH溶液的再生能力较好,再生10次后,频率响应下降到原有的75%。尿素溶液的再生能力较差,再生5次后,频率响应下降到原有的62%。石英晶体频率响应随再生次数的变化见图3、图4。
3 讨 论
3·1 免疫球蛋白联合检测的临床意义
免疫球蛋白在人类免疫应答中起关键作用。作为B淋巴细胞的细胞表面受体,免疫球蛋白在多种细胞活动中均扮演重要角色,这些活动包括细胞的活化、分化甚至凋亡。免疫球蛋白被分泌到血浆或其他体液中之后,能够与其中相应的抗原结合。多种疾病情况下都可见到免疫球蛋白的升高,如:感染、胶原性疾病、肝脏疾病等。这些疾病常伴随有多种免疫球蛋白的升高,对免疫球蛋白进行联合检测对疾病的诊断、治疗指导及预后评价具有重要的临床意义。有报道SARS患者同健康人群相比除IgD外,其他免疫球蛋白均明显升高[7]。
目前针对免疫球蛋白的检测方法主要有散射比浊法、ELISA法。其中散射比浊法具有操作简便、灵敏、结果准确等优点,但所需仪器价格昂贵,不适于推广[8]。ELISA法操作繁琐、费时。因此,寻找一种简单、灵敏、廉价,可精确定量的新方法具有重要的使用价值。压电石英晶体免疫传感器是近年来发展起来的一种新型免疫传感器器件,其对表面质量负载的变化非常敏感,具有ng级的检测能力。其操作简便、无需标记,能在线实时检测,灵敏度高、特异性好,有望成为未来临床大规模使用的检测手段[9,10]。
3·2 压电石英晶体免疫球蛋白传感器微阵列的设计
以所构建的压电石英晶体振荡频率检测平台和2×5型拔插式微阵列为基础,采用Y1、Y2两行各5个石英晶体传感器检测单元作为独立的两组免疫球蛋白检测组合。其中Y1行为参比行,Y2行为检测行。参比晶体不固定抗体分子,仅用SPA包被,然后用BSA封闭,以减少血清标本在检测过程中的物理吸附。这种检测方式使检测池和参比池同时进行检测,可直接得到除去物理吸附等影响因素的频率变化,减少了实验误差,使检测结果更真实。同时2×5型的点阵排列,便于自动加样系统的设计,为今后研制自动化和智能化的全自动检测仪打下了坚实的基础。
3·3 压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的响应特性
3·3·1 免疫传感器微阵列检测时间的确定
免疫反应具有阶段性,可分为特异性反应和非特异性反应两个阶段。特异性阶段,反应在数秒钟内完成,但不出现可见反应现象。压电石英晶体免疫传感器正是针对特异性反应阶段进行快速、灵敏的检测。将待测物分别加入传感器阵列中相应的检测单元中,37℃条件下检测石英晶体振荡频率的变化直至频率稳定,观察石英晶体振荡频率变化与抗原2抗体反应时间之间的关系。从免疫传感器微阵列频率变化趋势图中可以清楚地看出加入待测物后,石英晶体的振荡频率先随时间增加而迅速降低,随后逐渐变慢,当免疫反应进行约15 min时,石英晶体的振荡频率基本稳定,继续观察5 min,其振荡频率基本无变化(<1Hz/min),表明抗原2抗体反应已达到平衡,免疫反应已结束。因此,确定15 min为压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的检测时间,与相关文献所报道的检测时间一致[11]。
3·3·2 免疫传感器微阵列特异性的检测 通过用免疫传感器微阵列分别交叉检测其他4种免疫球蛋白标准血清,来检测免疫传感器微阵列的特异性。结果表明,构建的压电石英晶体免疫传感器所检测的待测物间无交叉反应,说明构建的压电石英晶体免疫传感器特异性好、选择性高,可满足临床检测的需要。
本实验中用于检测的抗体均为单克隆抗体,因此具有良好的反应特异性。其非特异性响应值低,对检测结果不构成影响。构建其他类型的免疫传感器时,可根据不同的待测物,选择相应的单克隆抗体,以提高反应的特异性。
3·3·3 压电石英晶体免疫球蛋白传感器微阵列对
临床标本的检测
人体血清标本本身的黏密度因素,对石英晶体表面的非特异性吸附,对结果的判读将造成一定的影响。在本课题的早期研究中,发现2倍稀释后的血清标本基本可消除黏密度因素的影响[12]。因此本实验中,除设置参比电极外,还根据文献报道,将血清标本进行2倍稀释后进行检测。利用免疫传感器微阵列对50例临床标本分别进行IgG、IgA、IgM、IgD、IgE检测,将检测结果与相应的其他检测方法进行相关分析,其相关系数依次为:0·94、0·94、0·94、0·92、0·91。结果表明,压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列的检测结果同传统免疫分析方法相比吻合度较高,可用于免疫球蛋白的临床检测,为免疫球蛋白的联合检测提供了一种简便、快速的新方法[13]。
3·4 压电石英晶体免疫球蛋白传感器微阵列的再生研究
使用过的石英晶体用1·2M的NaOH溶液及8·0M的尿素溶液再生后,用于相同浓度免疫球蛋白标准血清的检测。结果表明,再生后的石英晶体仍具有良好的频率响应特性,但其响应特性随再生次数的增加而逐渐降低。其中NaOH溶液的再生能力较好,再生10次后,频率响应下降到原有的75%。尿素溶液的再生能力较差,再生5次后,频率响应下降到原有的62%。电极的再生是发展免疫传感器中重要的一环[14,15]。抗原抗体间的结合力较弱且通常为可逆,要使免疫传感器重复使用,就要用一些试剂将抗原抗体复合物解离或从传感器表面全部清洗下来,前者还需不损害固相抗原或抗体的活性,因此所选择的试剂的浓度及作用时间需认真选择[16,17]。本实验所采用的1·2M的NaOH溶液再生效果较好,再生5次内频率响应的变化不大,再生5次后的石英晶体的频率响应逐渐下降,可能与抗体固定膜受到一定破坏有关,因此建议石英晶体的再生次数不亦过多,以免影响检测结果。同时也可根据所进行的免疫反应不同,采用不同的再生溶液及再生时间。
3·5 压电石英晶体免疫球蛋白传感器微阵列的特点与应用
在本研究中,我们选择临床应用较多的IgG、IgA、IgM、IgD、IgE作为检测物,构建压电石英晶体免疫球蛋白免疫传感器微阵列,可实现对其同时检测,解决了以往检测方法各异所造成的结果相关性差、检测周期长、所需标本量大,不能同时联合检测等缺点。
压电石英晶体免疫传感器作为一种新型生物传感器,具有快速、灵敏、实时检测、无需标记等优点,同时其可再生的特点,使其具有突出的优势和广阔的发展前景[18220]。
